(1)灭菌
分装好的原种瓶，要当天灭菌，以免培养基发霉变质。灭菌方法有二种，即高压蒸汽灭菌和常压蒸汽灭菌。
①高压蒸汽灭菌。先将锅内加入足够的水，将菌种瓶整齐地排放在锅内，盖上锅盖，对角拧紧锅盖上的螺丝，勿使漏气。用电炉或者煤火加热，当压力达到0.05兆帕时，打开放气阀（或开始就打开放气阀），排空锅内冷空气，放气10-15分钟左右，再关闭放气阀继续加热，当压力升到0.15兆帕时，调整火力使压力维持在0.14-0.15兆帕下灭菌。麦粒和谷粒培养基灭菌120分钟；棉籽壳、玉米芯、木屑培养基灭菌90-100分钟。灭菌完毕，关闭热源，待压力自然降到0时，打开放气阀将锅内空气排尽后，再打开锅盖取出菌种瓶。
②常压蒸汽灭菌。锅内加足水，先用大火加热，使蒸汽上足后，用小火保持沸点温度。在loo℃左右的沸点温度下维持12-16小时以上，停火焖1夜后出锅。麦粒和谷粒培养基灭菌时间要相应延长。为了确保灭菌效果，麦粒和谷粒培养基最好不要采用常压灭菌法。
(2)接种
①培养基冷却。将灭过菌的培养基从锅内取出，置于干净的室内冷却，待灭过菌的培养基温度降至30℃以下时，搬入消毒好的接种箱（室）内消毒接种。
②接种场地的消毒。在接种前先对接种场地和接种设施进行彻底的清洁，然后用甲醛加高锰酸钾或者克霉灵等气雾消毒剂熏蒸消毒30分钟。再将灭过菌的料瓶和接种用具（酒精灯和接种钩等）一同放入接种室（箱）内，用甲醛加高锰酸钾再一次进行熏蒸消毒，同时配合紫外灯照射消毒等方法。具体消毒方法及药品用量参见“母种的转接”。
③接种方法。首先将母种试管外壁用75%的酒精棉球表面消毒后带入接种室（箱）；点燃酒精灯，用75%的酒精棉球再次对试管外壁和管口处表面消毒：取下试管棉塞后，试管口在火焰上烧一下，然后用经火焰灭菌并已冷凉的接种钩将母种斜面分成6-8份，在酒精灯火焰形成的无菌区内，用接种钩取一份母种迅速准确地放入料瓶内的接种穴处，棉塞过火后塞好，包上包头纸。如此反复，每支母种可扩接原种6-8瓶。接完种，贴上标签。
(3)培养
将接种好的原种放置培养室内进行培养，培养室要求干燥、黑暗、通风良好，温度控制在20℃ -24℃，空气相对湿度在60%左右。培养期间每周检查1次菌丝生长情况和杂菌发生情况，若发现有污染的菌种瓶应立即淘汰，并隔离污染源。
一般在适温下30天左右菌丝即可发满菌种瓶，菌丝长满后，尽快使用；若暂时不用，也可置于低温、干燥条件下短期保存。
